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Lonza重组C因子法内毒素检测处置计划

作者:赛百奥市场部 日期:2022-03-26 点击:610
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Lonza重组C因子法内毒素检测处置计划


克日,受国度政策变更影响,内毒素检测试剂所用质料鲎(中国鲎及圆尾鲎)被列为国度二级掩护植物(国度林业和草原局、农业乡村部2021年2月25日通知布告(2021年第3号)),象征着内毒素检测试剂质料将遭到严酷管控,鲎试剂出产厂家传播鼓吹将遏制供给以下产物:

1、单支凝胶法鲎试剂 (0.1mL) - 活络度0.5、0.25、0.125、0.06 EU/mL将于本年 6月30日停产;

2、四次装凝胶法鲎试剂 (0.5mL) - 活络度0.25、0.125EU/mL将于本年 12月31日停产。

按照通知布告和LAL厂家的官宣,国际药品、医疗东西放即将面对窘境,药企、医疗东西企业须尽早挑选其余替换测试体例。今朝药典收录体例都因此鲎试剂为根本拟定,新体例只能寄但愿于找到LAL替换体例。

 

LAL替换品研讨停顿

说到寻觅鲎试剂(LAL试剂)的替换品,这实在在国际外一向是个热门话题。内毒素的节制在医疗、药品的研讨中利用很是普遍,传统的鲎试剂法中触及利用到太古生物鲎血液中的变形细胞,因为生态情况的好转,鲎数目大规模削减,相干研讨职员不时地研讨开辟内毒素的新体例以应答差别的检测须要。

 

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  鲎采血现场

  图片来历:Timothy Fadek/Corbis/Getty

 

磁弹性传感器测定法该体例利用应激反映磁弹性传感器,监测 LAL测定的凝胶构成(黏度变更)进而测定内毒素的总量[1]。在与差别内毒素浓度的测试样品夹杂后,将带状磁弹性传感器(12.7mm×6mm×28μm)浸入LAL 测定中,并记实传感器的共振幅度随时候的变更。尝试功效标明内毒素浓度与最大凝血率之间存在极好的相干性。磁弹性传感器的手艺能够或许在须要约莫 20 min 的测试中检测到0.0105EU/mL的内毒素。与用于肯定内毒素浓度的光学体例差别,测试溶液的色彩不影响磁弹性传感器丈量。因为传感器读取器电子器件的尺寸小且本钱低,基于磁弹性传感器的内毒素检测体系很是合适普遍用于内毒素的测定。该体例按照道理可合用于一切接纳 LAL 法测定的喷射性药品中。

 

生物传感器以鲎试剂的替换品为焦点的研讨,包含大批生物传感器的研讨[2]。针对细菌内毒素疾速、及时、活络的检测,生物传感器法是将来内毒素检测成长趋向之一。内毒素外表能够或许经由过程静电和疏水性物资与恰当润色的外表彼此感化,经由过程磷酸基团的配位,或更有挑选性地与辨认的卵白质或适体连系。按照这个道理相干的生物传感器能够或许分为卵白类、肽类、抗体类、适体类、细胞类等,而这些检测体例中,重组C因子法无疑是比拟风行的一种体例。

 

最近几年来,重组C因子法也是利用由圆尾鲎或西方鲎的基因克隆而制成的重组C 因子与内毒素反映,以起点法定量测定荧光底物的单步酶促反映裂解产物来量化细菌内毒素的一种体例[3]。国际已有相干的研讨报道[4]。欧洲药典委员会Ph. Eur.在第165届集会经由过程并在2021年1月1日已失效。

分解抗原簇卵白 14(CD14)[5]、Toll 样受体4(TLR4)和髓样分解卵白-2(MD-2)[6]、刀豆素A[7]、重组的抗鲎LPS因子[8-10]、CramoLL lectin[11]等卵白利用于内毒素的检测也获得了必然的功效,此中TLR4和MD-2为辨认传感器的电化学检测体例能够或许检测到0.000 5~5EU/mL的内毒素,刀豆素A 为辨认传感器的光学检测体例检测内毒素的规模在0.2~20 μg/mL。重组的抗鲎LPS因子为辨认卵白,检测活络度可达100pg/mL。

 

lonza重组抒发的C因子内毒素检测体例

成熟的重组C因子法内毒素检测手艺: 

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Lonza PyroGeneTM重组C因子试剂盒是内毒素检测体例的成长功效。经由过程体外重组鲎凝血级联反映的第一个组分:C因子,重组C因子法只要一部反映,优于传统LAL法且不依靠植物源成份-鲎血。

PyroGeneTM重组C因子法,激活的C因子间接剪切一个荧光底物,发生的旌旗灯号被荧光酶标仪辨认。因为荧光旌旗灯号的静态规模大,相较于传统的静态LAL法,PyroGeneTM重组C因子法只要一步反映,检测规模便可到达5.0EU/ml–0.005EU/ml。

 

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上图别离展现了PyroGeneTM重组C因子与传统LAL法,如静态显色法和静态浊度法的激酶级联反映。

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合规审批汗青

2012年6月,FDA将重组C因子法归入可替换体例;

2015年7月,欧洲药典将重组C因子法归入可替换体例;

2018年9月,FDA核准了首个以重组C因子检测内毒素的单抗药;

2018年12月,欧洲药典收罗定见稿将重组C因子归入欧洲药典;

2019年1月,中国药典收罗定见稿将重组C因子归入2020版中国药典- 2020版药典已归入,作为可替换计划;

2019年12月,欧洲药典将重组C因子归入到新一版的欧洲药典中,估计2021年失效。

* 根据美国药典(USP) <1225>和人用药品注册手艺请求国际调和集会(ICH)Q2B,重组C因子法只是被视为“替换检测体例”。这象征着羁系机构只会承认做过考证研讨的重组C因子检测功效,并且必须对利用该体例检测的每一个产物停止考证研讨。(考证研讨凡是是用来比拟替换体例和药典体例,考证二者之间的相干性。颠末考证以后,跟进药物或东西的羁系备案是须要的)。

  

Lonza rFC 产物

产物称号

活络度 EU/mL

检测

货号

PyroGene™  Recombinant Factor C Assay

0.005 to 5

192tests/kit

50-658U

PyroGene™  Recombinant Factor C Assay

0.005 to 5

2880tests/kit

50-658NV

PyroWave™  XM Fluorescence Reader



25-345S

WinKQCL™  6 Software Package



25-611

 







重组C因子是一种化学分解的试剂,性状更不变,均一性绝对也更好。试剂价钱今朝和鲎试剂相称,前期如在国际外普遍利用起来,价钱会比鲎试剂更具合作上风。


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1、内毒素检测装备

2、内毒素检测试剂

 

参考文献:

[1]:Ong K G, Leland J M, Zeng K, et al. A rapid highly-sensitive endotoxin detection system [J]. Biosens Bioelectron, 2006, 21(12): 2270-2274.

[2]:Su W, Ding X. Methods of Endotoxin Detection [J]. J Lab Autom. 2015, 20(4): 354-364.

[3]: 裴宇盛,蔡彤,高华.细菌内毒素查抄新体例停顿 [J].药物阐发杂志, 2014, 34(3): 392-395.

[4]:裴宇盛,蔡彤,陈晨,等.重组 C因子法检测福沙匹坦二葡甲胺中细菌内毒素的体例学研讨 [J].中国古代利用药学, 2019, 36(1): 1-4.

[5]:Burkhardt M, LopezAcosta A, Reiter K, et al. Purification of soluble CD14 fusion proteins and use in an electrochemiluminescent assay for lipopolysaccharide binding [J]. Protein Expression Purif, 2007, 51(1): 96-101

[6]:Yeo T Y, Choi J S, Lee B K, et al. Electrochemical endotoxin  sensors based on TLR4/MD-2 complexes immobilized on gold electrodes [J]. Biosens Bioelectron, 2011, 28(1): 139-145.

[7]:Hreniak A, Maruszewski K, Rybka J, et al. A luminescence endotoxin biosensor prepared by the sol-gel method [J]. Opt Mater (Amsterdam, Neth) 2004, 26(2): 141-144.

[8]: Pallarola D, Battaglini F. Surfactant-assisted lipopolysaccharide conjugation employing a cyanopyridinium agent and its application to a competitive assay [J]. Anal Chem, 2009, 81(10): 3824-3829.

[9]:Priano G, Pallarola D, Battaglini F. Endotoxin detection in a competitive electrochemical assay: synthesis of a suitable endotoxin conjugate [J]. Anal Biochem, 2007, 362(1): 108-116.

[10]:Priano G, Battaglini F. Use of an antimicrobial protein for endotoxin detection in a competitive electrochemical assay [J]. Anal Chem, 2005, 77(15): 4976-4984.

[11]:Oliveira M D L, Andrade C A, Correia M T, et al. Impedimetric biosensor based on self-assembled hybrid cystein-gold nanoparticles and CramoLL lectin for bacterial lipopolysaccharide recognition [J]. J Colloid Interface Sci, 2011, 362(1): 194-201.